高通量测序技术简介

发布人:系统管理员  发布日期:2015-07-27  点击:

 

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变,一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定,因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing),足见其划时代的改变,同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,所以又被称为深度测序(deep sequencing)。根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等,主要有以下几种:大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆(Polony Sequencing)454焦磷酸测序(454 pyrosequencing)Illumina (Solexa) sequencingABI SOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)DNA 纳米球测序 (DNA nanoball sequencing)等。

1实验过程 1)样本准备(sample fragmentation);(2)文库构建(library preparation);(3)测序反应(sequencing reaction);(4)数据分析(data analysis)

2测序平台 自从2005454 Life Sciences公司(2007年该公司被Roche正式收购)推出了454 FLX焦磷酸测序平台(454 FLX pyrosequencing platform)以来,因为其拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列(series capillary array electrophoresis sequencing machines)遇到了2个强有力的竞争对手,曾推出过3730xl DNA测序仪(3730xl DNA Analyzer)Applied BioSystem(ABI),一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了,一个是罗氏公司(Roche)454 测序仪(Roch GS FLX sequencer),另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台(Genome Analyzer platform),为此,2007ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这3个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。

    3技术应用 

3.1测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展,科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(de novo sequencing),获得该物种的参考序列,为后续研究和分子育种奠定基础;对有参考序列的物种,进行全基因组重测序(resequencing),在全基因组水平上扫描并检测突变位点,发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序(whole transcriptome resequencing),从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究;或者进行小分子RNA测序(small RNA sequencing),通过分离特定大小的RNA分子进行测序,从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上,与染色质免疫共沉淀(ChIP)甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合,从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

3.2需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用——目标序列捕获测序技术(Targeted Resequencing)。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针,这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合,从而富集到特定区段,然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有AgilentNimblegen ,应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势,不仅是费用较低,更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小,与生物学表型结合更为直接。

3.3目前,高通量测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变,Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用Agilent SureSelect序列捕获和SOLiD4例患者的外显子组进行测序,平均覆盖度为43倍,读长为50 nt,每个个体产生了2.73 GB可作图的序列数据。聚焦于全部4例患者都携带变异体12个基因,最终将候选基因缩小至1个。而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以Science杂志年度十大科学突破的疾病进行研究,包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病,以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。前不久刚刚结束的评选中,外显子组测序名列其中。

3.4 除了第二代测序之外,还有另外一种以单分子实时测序和纳米孔为标志的第三代测序技术也正在如火如荼的发展中,只是还没有正式发布,所以目前科学界所说的高通量测序还指的是第二代测序。

   综上所述,高通量测序技术的诞生可以说是基因组学研究领域一个具有里程碑意义的事件。该技术使得核酸测序的单碱基成本与第一代测序技术相比急剧下降, 以人类基因组测序为例, 上世纪末进行的人类基因组计划花费 30 亿美元解码人类生命密码, 而第二代测序使得人类基因组测序已进入万()元基因组时代。如此低廉的单碱基测序成本可以实施更多物种的基因组计划,从而解密更多生物物种的基因组遗传密码。同时在已完成基因组序列测定的物种中, 对该物种的其他品种进行大规模地全基因组重测序也成为可能。

 

 

 

                                                                                                                 《检验医学与临床》编辑部

                                                                                                                         2015.7.24